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以下是关于 ATP 酶染色的相关介绍:
基本原理
ATP 酶是一种水解酶,可催化 ATP 分解产生能量。在 ATP 酶染色中,常用的是钙钴法,其原理是 ATP 酶水解 ATP 为 ADP 和磷酸,磷酸与钙离子在酶活性部位结合形成无色的磷酸钙沉淀,磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴,再经硫化铵处理便形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位,从而通过观察沉淀的分布和颜色深浅来显示 ATP 酶的分布和活性情况。
操作步骤
取材与冷冻切片:麻醉动物后,在偏离麻醉剂注射的位置选取肌肉取材部位,划开皮肤及目标肌肉,切下大小约为 10mm×5mm×5mm 的肌肉块,将其置于用生理盐水湿润过的纱布上。把装有异戊烷的离心管置于液氮中预冷至底部结霜,然后将肌肉块浸入预冷好的异戊烷中,匀速顺时针旋转 40-60 次,再迅速将其置于封口袋中并放入液氮中保存。最后使用冷冻切片机对冷冻的肌肉块进行切片。
试剂配制:配制预孵育液、增强洗液、孵育液、氯化钴溶液及硫化铵溶液等试剂备用。其中预孵育液一般由乙酸钠、巴比妥钠、双蒸水等原料混合而成。
染色处理:室温下将切片置于预孵育液中处理 3-5min,处理完后取出切片并置入增强洗液中洗 15-30s,随后将切片浸入孵育液中 37℃处理 25-30min,再将切片浸入氯化钴溶液中处理 3-5min,取出后先用自来水冲洗数次,再用双蒸水洗 4 次,随后将切片浸入硫化铵溶液中处理 20-30s,最后流水冲洗,然后脱水封片。