共聚焦显微镜大的方向分为转盘共聚焦、点扫共聚焦；其中点扫共聚焦又可细分为工业共聚焦和生物共聚焦，这三种共聚焦都是在传统显微镜的基础上，引入了微小针孔（通常几十个微米大小），用于屏蔽非焦平面上的杂散光信号，只保留焦平面上的光信号，从而提升图像的信噪比、对比度，相当于提升了分辨率能力。下面逐一帮你介绍三种共聚焦的原理。

1.生物共聚焦，全称激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，简称CLSM）

生物共聚焦的核心原理可以概括为：“点照明、点探测”，通过一个关键部件——针孔，来消除焦平面外的干扰光，从而实现高分辨率和光学切片能力。

生物共聚焦原理图

如上图所示，激光光束经过准直后，经二向色镜反射进入“Scanner”的扫描振镜，然后通过物镜将光束汇聚到样本上，汇聚点所在的平面我们称之为焦平面。激光激发生物样本上的荧光信号后，焦平面上的荧光信号沿着红色虚线的逆回路后，可以通过针孔单元，进入探测器，从而形成样本图像；而非焦平面上的荧光信号银子灰色虚线逆回路回去后，被针孔隔挡住了，进入不了探测器。因此提高了信噪比、对比度。

完整的工作流程如下图所示。

共聚焦显微镜工作流程

分步原理解释

首先：点照明

• 如流程图起点所示，一束激光通过扫描振镜控制其偏转。

• 激光通过物镜后，被聚焦到样品内部一个非常小的点上（即焦平面上的焦点）。

• 扫描振镜的摆动，使得这个激光焦点在样品上进行逐点、逐行的扫描，就像在“阅读”一幅图像。

其次： 荧光激发与信号收集

• 激光焦点照射到荧光样品上，该点的荧光分子被激发，向各个方向发射出波长更长的荧光。

• 这些荧光信号（包括来自焦平面的清晰信号和来自非焦平面的模糊杂散光）被物镜收集，并沿原路返回。

核心关键：针孔的空间滤波作用

这是共聚焦原理中最关键的一步，对应流程图中的“针孔滤波效应”模块。

• 返回的光线通过二向色镜（一种特殊滤光片，反射激发光但透射发射光）后，被引导至探测器路径。

• 在探测器（通常是光电倍增管PMT）前方，放置着一个针孔。
  

• 来自焦平面的信号：这些光线会准确地汇聚在针孔上，从而顺利通过并被探测器接收。

• 来自非焦平面的信号：这些光线无法汇聚在针孔上，而是形成一个弥散斑，绝大部分被针孔阻挡，无法到达探测器。

针孔的作用就像一个“空间滤波器”，只允许焦点的光通过，有效地抑制了焦外模糊光。

最后： 信号检测与图像重建

• 探测器（PMT）是一个点探测器，它将接收到的每一个光点信号转换成电信号。

• 计算机同步记录下每个光点信号的强度，以及该点对应的扫描振镜的位置坐标（X, Y）。

• 通过将每个点的信号强度与位置信息一一对应，计算机就能在屏幕上逐点重建出一幅具有高对比度和高信噪比的二维图像。

2.工业共聚焦显微镜

工业共聚焦同样严格遵循 “点照明、点探测” 这一共聚焦基本法则，通过针孔来消除焦点外的反射或散射光，实现高信噪比和高轴向分辨率。其基本光路与生物共聚焦类似，但光源和探测器通常针对反射光信号进行优化：

工业共聚焦工作流程

工业共聚焦显微镜是将共聚焦光学原理与工业计量需求完美结合的产物。它通过色差编码高度、光谱仪解码以及线扫描技术，实现了对工业零部件表面形貌的高速、高精度、非接触式三维测量。

3.转盘共聚焦

转盘共聚焦是为了提升扫描速度，在点扫共聚焦的基础上，引入了多个针孔，进行多点同时探测。转盘共聚焦显微镜的工作原理。它是点扫共聚焦显微镜家族的的变体，核心设计目标是在保持共聚焦切片能力的同时，实现高速、低光毒性成像，尤其适用于活细胞长时间动态观察。其光路如下图所示。

转盘共聚焦原理

如上图所示，转盘共聚焦通常由两个转盘构成（也有单转盘形式），绿色激光束通过转盘上的针孔和显微物镜后，将光束聚焦在样本上，激发出来的荧光信号，焦平面的荧光信号沿红色光路进入探测器，形成图像，非焦平面的荧光信号沿黄色光路被针孔阻隔掉，从而实现了分辨率的提升。详细工作流程如下图所示。

转盘共聚焦的工作流程

转盘共聚焦的几个关键步骤包括：

照明（自上而下）

• 一束扩束后的激光照射在转盘上。

• 激光首先通过微透镜阵列，每个微透镜都将激光高效地汇聚到其后对应的针孔中。

• 光线通过针孔后，被物镜捕获，并在样品焦平面上聚焦成成千上万个离散的、明亮的共聚焦光点。

• 转盘高速旋转，使得这些光点阵列在样品上快速扫描，在相机曝光的一次时间内，就能覆盖整个视场。

探测（自下而上）

• 从样品上被激发的荧光信号，沿原路返回，通过物镜，再次到达转盘。

• 来自焦平面的信号：由于光路可逆，从焦平面光点发出的荧光会准确地返回到对应的针孔，并顺利通过，到达探测器。

• 来自非焦平面的信号：这些离焦的杂散光无法聚焦到针孔上，因此绝大部分被转盘阻挡，无法到达探测器。

图像合成

• 探测器是一个高速科学级相机，通常为sCMOS，而非点扫共聚焦使用的探测器（如PMT）。

• 相机进行全场曝光，在一次曝光中，同时收集所有通过针孔的荧光信号。

• 随着转盘旋转，所有点在一个周期内完成扫描，相机最终捕获的是一幅完整的、具有共聚焦效果的二维图像。

总结

点扫共聚焦和转盘共聚焦有各自的优劣势，适合于不同的实验场景，主要区别如下表所示。

文章出自 科研实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/